ELISA检测中常见的酶及底物

辣根过氧化物酶HRP

    HRPzui常用的色原底物有邻苯二胺（OPD）、2，2’—吖嗪—（3—乙酰苯基噻唑磺酸—6）[2，2’—azino-di（3—ethylben2thiazolinesulphonicacid-6），ABTS]（杂环吖嗪）、四甲基联苯胺（TMB）和4—氨基安替比林：苯酚耦联底物对等。上述色原底物受HRP作用主要有两种形式的反应：①氧化还原底物的氧化作用，如OPD、ABTS等；②一个氨基芳香剂与另一个芳香基化合物的氧化耦联，如4—氨基安替比林：苯酚等。

    （一）氧化还原色原底物

    OPD被认为是HRPzui为敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下，由过氧化氢（H₂0₂）

氧化而聚合成2，2’—二氨基偶氮苯（DAB）。在pH5．0左右时，DAB在波长450nm处有广范围的zui大吸收，当pH值降为1．0时，zui大吸收波长移动至492nm，同时摩尔消光系数变大，显色加深（图4—2）。因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。实际工作中，用强酸尤其是盐酸终止反应后，显色并不稳定，常随时间增长而颜色加深，这是由于反应后剩余的过氧化氢继续氧化OPD而产生非酶催化的DAB的结果。有人在强酸反应终止液中加入还原剂如亚硫酸钠，因还原剂可迅速*地将剩余的过氧化氢还原而阻止了OPD的非酶氧化，结果显色稳定，数十小时内不变，而且无需避光。OPD的缺点是其对机体具有致突变作用。由于OPD的不稳定性，现在的商品试剂盒中，OPD均以片剂或粉剂供应，临用时再溶解于相应的缓冲液。

    在ELISA测定时，OPD色原底物的具体配方为①显色底物溶液：在0．1mol／L枸橼酸盐缓冲液（pH5．0）中含20 mmol／L OPD和12 mmo!／L H₂0₂，或10 mmol／L OPD和5．5mmol／L H₂0₂；②终止液：2 mol／L硫酸（含0．1 mol／L亚硫酸钠）；③测定波长：492nm。

    TMB是一种优于OPD的新型HRP色原底物。其氧化产物联苯醌在波长450nm处有zui大消光系数，如果HRP量少，过氧化氢溶液和TMB过量时，则形成蓝色的阳离子根。降低pH，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌（图4—3）。使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min，但随后本底显色就不断加深，国内有人认为使用1％SDS作为终止剂，可使鲜蓝色24h内保持不变，阴阳性对比十分明显，但在我们实验室发现1％SDS对上述显色有较强的褪色作用，目前仍以硫酸作为终止剂较为理想。ELISA中，底物反应显色后，常选择其具zui大吸收的波长450nm比色测定结果。而’Madersbacher和Berger等为提高以TMB作底物的ELISA测定的敏感性，选择显色呈指数加深时的波长405nm比色测定。他们首先测定一系列已知浓度的标准品在450nm和405nm的值，证实A450nm／A405nm之比为3．2，然后在使用波长405nm测定含低浓度待测物的标本得到的OD值再乘以常数3．2，即为待测标本在波长450nm处的真值。该种双波长测定方法可使ELISA测定范围提高3倍。TMB的显色反应虽与OPD一样同属氧化还原反应，但前者的反应是可逆的，如终止液中存在还原剂（维生素C及亚硫酸钠、SDS等），则可反应显色迅速消退。TMB虽然溶解度相对较低，但由于其高检测敏感性及无致突变作用，现已基本上取代了OPD而成为HRPzui为常的色原底物。

    在商品ELISA试剂盒尤其是国内的产品中，TMB色原底物常为已配好的A及B两种液态试剂，其中一种是含一定浓度过氧化氢的溶液，一种为TMB溶液，鉴于过氧化氢、TMB在溶液中相对不稳定的特点，因此，我们在使用ELISA试剂盒时，如发现底物A和（或）B出现颜色，或二者各取一滴混合后显色，说明该试剂盒的底物溶液已变质或已受污染，必须废弃。

    在ELISA测定时，TMB色原底物的具体配方为①显色底物溶液：先将TMB以0．1 mol／L的浓度溶于二甲亚砜，然后，再将其以1 mmol／L和H₂0₂以3．0 mmol／L的浓度溶于0．2mol／L醋酸钠／枸橼酸缓冲液（pH4．0），即可应用。②终止液：2 mol／L硫酸。③测定波长：450nm。

    ABTS也是HRP的一种高灵敏底物。在H：O：存在下，ABTS的氨盐转变为易发生歧化的阳离子根（图4—4）。阳离子根为绿色，与OPD的黄色氧化产物相比更适于可见光测定（测定波长入＝414nm）。上述显色也不稳定，10 mmol／L叠氮钠是较为理想的终止剂，可使显色稳定数十小时，且可减少阳离子根的歧化。另有人报道用1．25％NaF终止反应效果较好。

    ABTS在目前国内的ELISA试剂盒中基本上没有应用，但在国外ELISA试剂盒偶见有应用。

    在ELISA测定时，ABTS色原底物的具体配方为①显色底物溶液：先将ABTS以2 mmol／L和H₂0₂以2．5 mmo!／L的浓度溶于0．1 mol／L醋酸盐缓冲液（pH 4．2），即可应用；②终止液：10 mmol／L叠氮钠；③测定波长；414nm或405nm。

    除上述三种外，HRP的氧化还原底物尚有O-dianisidine（ODA），5—氨基水杨酸（5—AS）以及dicarboxindine等。

    （二）氧化耦联色原底物对

HRP的氧化耦联色原底物对主要有4—氨基安替比林：苯酚耦联底物对（Trinder试剂）和2—甲基—2—苯并噻唑啉腙（MBTH）；二甲基苯胺（DMA）耦联底物对（Ngo—Lenhoff试剂）等。

    在H₂0₂存在下，4—氨基安替比林和苯酚经HRP作用缩合形成红色的醌亚胺，其在入＝492 nm处有zui大吸收（图4—5）。

    该耦联色原底物对用于固相ELISA时，敏感性一般较低，反应见光不稳定，而且苯酚易发生多聚化，缺乏适当的反应终止剂。因此，该试剂常限于葡萄糖、三酰甘油、肌酸激酶等临床生化指标的酶法检测应用。1989年日本学者用其作为色原底物建立了一种以HRP作标记酶的均相酶免疫试验，可用甲醛终止反应。但这种方法仅停留在实验室阶段，其后也未见有其他实验室的应用报道，可能还有其固有的缺陷。

    4—氨基安替比林：苯酚耦联底物对色原底物的具体配方为①显色底物溶液：将4—氨基安替比林以2 mmol／L，苯酚以25 mmol／L和H₂0₂以0．8 mmol／L的浓度溶于0．1 mol／L磷酸盐缓冲液（pH7．2），即可应用；②终止液：未见报道；③测定波长：492nm。

    MBTH和DMA在HRP的作用下缩合生成紫蓝色的吲达胺（indamine），zui大吸收波长为590nm，见光不稳定。用盐酸或硫酸终止反应后，pH应为3．0左右，pH值的降低使显色从紫蓝色转变为清晰的蓝色，zui大吸收波长从590nm变为595nm，然而pH值的进一步降低，将导致光吸收消失。

    MBTH：DMA耦联对在固相ELISA测定几乎没有应用。

碱性磷酸酶（AP）

    在ELISA测定中，碱性磷酸酶的色原底物zui常用的是对硝基苯磷酸盐（p-nitropheny—

|phosate，pNPP）。pNPP在碱性磷酸酶的作用下生成对硝基酚（pNP），其在入＝405 nm处有zui大吸收.

    由于碱性条件下pNP的光吸收增强，并可使碱性磷酸酶失活，因而可使用碳酸钠作为终止剂。二乙醇胺缓冲液中不能有单乙醇胺，因为单乙醇胺对碱性磷酸酶有温度依赖的抑制作用。较高浓度的无机磷可竞争性地抑制碱性磷酸酶的活性，pNPP贮存时间过长由于非酶水解而产生硝基酚和磷酸盐时即可出现这种情况，此时pNPP呈黄色。

    因此，用于ELISA测定时，pNPP必须五色。pNP的摩尔消光系数（光吸收）的变化取决于溶液的pH及温度、离子强度、蛋白含量，当温度从15~C升高至45℃时，pNP在入＝405 nm处的光吸收将增加5％～7％。

    在ELISA测定时，pNPP色原底物的具体配方为①显色底物溶液：将pNPP以10 mmol／L的浓度溶于含1 mmol／LMgCl：的0．1 mol／L二乙醇胺缓冲液（pH 9．8），即可应用；②终止液：0．5 mol／L碳酸钠；③测定波长：405nm。